道理

抗体：介导体液免疫的沉要效应分子，是B细胞接受抗原激活后增殖分化为浆细胞所合成排泄的一类能与相应抗原特异性结合的、拥有免疫职能的球蛋白。
克隆(clone)： 是指无性滋生细胞系，是由单一个祖先细胞割裂滋生而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变产生，其基因是齐全一样的。

多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种蕴含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的分歧抗体。所获得的免疫血清现实上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。

多克隆抗体造备的意思

免疫血清：将抗原注入机体所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，含有这种特异性抗体的血清。
免疫血清作用：对传染病的诊断、预防和医治有沉要意思，并且对器官移植，肿瘤以及某些科研工作也有沉要意思。

多克隆抗体优弊端

   利益 ：作用全面，拥有中和抗原，免疫调度，介导补体介导的细胞毒作用，ADCC等作用，起源宽泛，造备容易。
   弊端：特异性不高，易产生交叉反映，从而利用受限。

多克隆抗体造备流程

（一）免疫原的造备
（二）免疫动物
（三）免疫血清的网络
（四）免疫血清的鉴定
（五）免疫血清的保留

多克隆抗体操作步骤

一、免疫原的造备
免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最沉要的性质是免疫原性（immunogenicity）
免疫原—天然抗原、人为  合成抗原
；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原
；
（一）细胞性抗原造备：
   绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素
；
   细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）
（二）可溶性抗原造备：指蛋白质、多糖和脂类等。
1）细胞的破碎（物理法、化学法）
2）提取与纯化：

    ①超快离心分离—是一种凭据分离物质的比沉特点，通过差快或梯度密度离心，将分子大幼分歧的抗原颗粒分隔的步骤，只合适少数大分子物质的分离。
②选择性沉淀—选择某抗道理化个性，选取相应沉淀剂或溶液环境。
③超滤法—利用孔径大幼分歧的特造薄膜对分歧分子大幼的抗原物质进行滤筛。
④层析法—凝胶过滤、离子互换、亲和层析
⑤电泳——

3）鉴定：鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。
（三）半抗原性免疫原的造备

    1.载体选择
常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。
（1）蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。
（2）多肽类聚合物：是由人为合成的多肽聚合物，也是一类优良的载体，常用的有多聚赖氨酸。
（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，参与福氏齐全佐剂可诱导动物产生优良的抗体。
2.衔接步骤
         半抗原与载体的衔接有物理法和化学法。
物理法   是用物理吸附法将载体与半抗原衔接，其道理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体重要有PVP和CMC等
；
化学法   是利用某些职能基团把半抗原衔接到白质类或多肽类聚合物载体上。分歧的半抗原应选用分歧的步骤进行衔接。

（四）免疫佐剂
某些物质与抗原一路或吓宗抗原注入机体，可加强机体对该抗原的特异性免疫应答或扭转免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。 

二、动物免疫
（一）免疫动物的选择
选择动物时应试虑以下成分：
（1）动物的选择（选择动物时应试虑以下成分）
①抗原起源与动物种属的关系？乖钠鹪从朊庖叨镏质舨罹嘣皆，其免疫源性越强，免疫成效越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫成效越差。
②动物个别的选择。适龄、健全、体沉切合要求的正常动物（以雄性为佳）
；抗体必要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等幼动物
；抗体必要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。
③通常尝试室选取的抗体，多用兔子和羊
；
（二）佐剂
概想：预吓纂抗原同时注入体内，可加强机体对该抗原的免疫应答或扭转免疫应答类型的非特异性免疫加强性物质。
种类：佐剂通常蕴含以下几类：
①无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等
②生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、幼棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单元、胞壁酰二肽和细胞因子等
；
③人为合成佐剂：  如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）
；
④油剂：如弗氏齐全佐剂、花生油乳剂等
；
⑤纳米佐剂 
佐剂重要作用机造：
①扭转抗原物理性状，延缓抗原的降解和排除，耽搁抗原在体内滞留的功夫
②刺激单核-巨噬细胞系统，加强其匹敌原的处置和提呈能力
③刺激淋巴细胞的增殖分化，从而加强和扩大免疫应答的能力.
（三）免疫乳剂的造备
（四）免疫动物

三、免疫血清的网络
采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周实时采血，不然抗体效价会降落。
①颈动脉采血法
②心脏采血法
③静脉采血法
 
四、免疫血清的鉴定 
1.效价的测定：颗粒性抗原可选取凝聚试验，可溶性抗原常用双向免疫扩散试验、ELISA等步骤。
2.特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、免疫电泳法
3.纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定可选取SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、免疫电泳等步骤。IgG含有沉链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE了局应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则批注造备的抗体混有杂蛋白，需进一步纯化。
4.亲和力的鉴定：测定抗体亲力的步骤较多，如平衡透析法、ELISA或RIA竞争结合试验等。

五、免疫血清的保留
取好血后，放入37℃，30min后，使血清充分析出（不能冰冻，不然产生溶血），经3000rpm/5min分离血清，渣滓放进-20℃冰箱保留。

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